Die Serie beschreibt die Einsätze der Kripo Autobahn, einer fiktiven Abteilung der Autobahnpolizei. Die Hauptpersonen sind zwei Polizisten, die zusammen das Cobra-11-Team bilden. Zu Anfang sind dies Kriminalhauptkommissar Frank Stolte und Kriminalhauptkommissar Ingo Fischer. Nach zwei Folgen tritt jedoch bereits Kriminalhauptkommissar Semir Gerkhan an die Stelle von Ingo Fischer, nachdem letzterer bei einem Einsatz erschossen wurde. Nach weiteren sieben Folgen wird Frank Stolte durch Kriminalhauptkommissar André Fux ersetzt. Dieser stirbt nach 47 gesendeten Folgen, als er bei einem Einsatz auf Mallorca nach einem tödlichen Harpunenschuss ins Mittelmeer fällt – seine Leiche wird jedoch nie gefunden.

Ab dem Pilotfilm zur 5. Staffel, Höllenfahrt auf der A4 (Regie: Raoul W. Heimrich), welcher eine bis auf einzelne Details fast exakte Kopie des US-amerikanischen Filmes Runaway Car darstellt, übernimmt Kriminalhauptkommissar Tom Kranich dessen Position. Das Team aus Semir und Tom ist das wohl bekannteste und besteht – mit Unterbrechung – über mehr als sieben Jahre. Im Pilotfilm zur 12. Staffel Feuertaufe erhält Semir einen neuen Partner, da Tom nach dem Mord an seiner schwangeren Freundin durch einen Drogenhändler psychisch belastet ist und seinen Polizeidienst vorübergehend an den Nagel gehängt hat. Sein Nachfolger wird der junge und dynamische Kriminalkommissar Jan Richter, der vom Diebstahldezernat zur Autobahnpolizei versetzt wurde. Jan ist nach der Folge 125 Extrem, in der ein Undercover-Einsatz für ihn fast tödlich geendet hat, nicht mehr dabei. Zu Beginn der 15. Staffel (Folge 126 Comeback) sucht Semir Tom auf, da seine Hilfe zur Aufklärung eines neuen Falls benötigt wird – er ist der Einzige, der das Gesicht eines totgeglaubten und bis dato nicht identifizierten Bombenlegers kennt. Am Ende der Folge fängt Tom offiziell wieder bei der Autobahnpolizei an, obwohl er eigentlich aufhören wollte. Diese Entscheidung erweist sich gerade auch für Semir als tragisch, denn Tom Kranich wird in der Folge 158 Auf Leben und Tod erschossen. Ab der 19. Staffel folgt ihm Kriminalhauptkommissar Chris Ritter, welcher nach nur drei Staffeln wieder aussteigt, indem er bei einem Undercovereinsatz ums Leben kommt. Seit Episode 180 (22. Staffel, 2008) spielt Tom Beck die Rolle des neuen Partners, Kriminalhauptkommissar Ben Jäger.